بررسي عفونت ريوي مايكوپلاسمايي ناشي از مايكوپلاسما مايكوئيدس واريته مايكوئيدس و مايكوپلاسما كاپري كولوم واريته كاپري كولوم در گوساله‌ها و بزهاي كشتارشده به روش PCR

فهرست

عنوان …………………………………………………..

الف- مقدمه………………………………………. ۱

ب-چکيده…………………………………………. ۳

فصل اول:کليات …………………………………… ۵                                                                                                                  

۱- تاريخچه  …………………………………… ۶                                                                                                              

۲- خصوصيات کلي مايکوپلاسما…………………………. ۶

۳- مقاومت مايکوپلاسماها…………………………… ۸

۴- طبقه بندي مايکوپلاسماها………………………… ۹

۵- طبقه بندي کلاستر مايکوئيدس……………………… ۱۲

۶- فيلوژني……………………………………… . ۱۴

۷- ساختمان ……………………………………. ۱۵

۱-۷-ساختمان مايکوپلاسما مايکوئيدس …………………… ۱۵

۲-۷- ساختمان مايکوپلاسما کاپري کولوم ………………. ۱۷

۸- بيولوژي مولکولي………………………………. ۱۹

۹- توالي‌هاي تکراري………………………………. ۲۳

۱۰- پروتئينهاي سطحي……………………………… ۲۵

۱۱- فاکتور حدت………………………………….. ۳۰

۱۲- آناليز پروتئين …………………………….. ۳۲

۱۳- طبقه بندي سويه‌ها ……………………………. ۳۴

۱۴- مشخصات گونه مايکوئيدس………………………… ۳۵

۱۵- کشت و رشد گونه مايکوئيدس …………………….. ۳۸

۱۶- کشت و رشد گونه کاپري کولوم …………………… ۴۱

۱-۱۶- محيط Thiacourt ……………………………… 41

۱۷- بيماري پلوروپنوموني واگير گاوان……………….. ۴۴

۱-۱۷- علائم باليني ……………………………….. ۴۵                                      

۲-۱۷- علائم کالبدگشايي بيماري ……………………… ۴۷

۳-۱۷- پاتوژنز …………………………………… ۵۰

۱-۳-۱۷- مکانيسمهاي مقابله با دستگاه ايمني…………… ۵۳

۴-۱۷- اختصاصيت ميزبان…………………………….. ۵۷

۵-۱۷- انتقال بيماري …………………………….. ۵۸

۶-۱۷- سير همه گيري ………………………………. ۵۹

۱-۶-۱۷- مخزن…………………………………….. ۵۹    

۲-۶-۱۷- راه انتقال……………………………….. ۵۹

۷-۱۷- پيشگيري و کنترل…………………………….. ۶۰

۱-۷-۱۷- اقدامات لازم براي حفاظت مناطق عاري از بيماري….. ۶۱

۲-۷-۱۷- اقدامات لازم هنگام شيوع بيماري………………. ۶۲

۳-۷-۱۷- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومي…………….. ۶۳

۱۸- بيماري پلوروپنوموني واگير بزان ……………….. ۶۳

۱-۱۸- علائم باليني ……………………………….. ۶۴

۲-۱۸- علائم کالبد گشايي……………………………. ۶۶

۱۹- گونه مايکوپلاسما کاپريکولوم کاپريکولوم………….. ۶۹

۱-۱۹- سندروم MASKePs…………………………….. 70

۲-۱۹- علائم باليني………………………………… ۷۱

۳-۱۹- علائم کالبد گشايي……………………………. ۷۱

۴-۱۹- سندروم آگالاکتيه واگير……………………….. ۷۳  

۲۰- گونه مايکوپلاسما کاپري ……………………….. ۷۳

۱-۲۰- بيماريزايي ………………………………… ۷۳

۲-۲۰- علائم کالبد گشايي……………………………. ۷۴

۲۱- سير همه‌گيري………………………………… ۷۵

۱-۲۱-مخزن……………………………………… .. ۷۵

۲-۲۱-راه انتقال………………………………… ۷۶

۳-۲۱-جمعيت ميزبان………………………………. ۷۷

۲۲-پيشگيري وکنترل ……………………………… ۷۷

۱-۲۲- اقدامات لازم براي محافظت مناطق عاري از بيماري…. ۷۷

۲-۲۲- اقدامات لازم هنگام شيوع بيماري………………. ۷۸

۳-۲۲- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومي…………….. ۷۸

۲۳-واکسن…………………………………………. ۷۹

۱-۲۳-واکسن MmmLC ……………………………… 79

۲-۲۳-واکسن Mccp ………………………………… 79

۳-۲۳-واکسن Mcc ………………………………… 79 79-اختصاصيت ميزبان در کلاستر مايکوئيدس ……………… …….   ۸۰

 

۲۵-تشخيص افتراقي……………………………….. ۸۰

۱-۲۵-شناسايي عامل بيماري زا …………………….. ..      ۸۱

۱-۱-۲۵-بررسي ميکروسکوپيک اگزوداي ريه از طريق تهيه اسمير يا برش بافتي     ۸۱

۲-۲۵- تشخيص آزمايشگاهي …………………………. ۸۱

۱-۲-۲۵- روش کشت و جداسازي………………………… ۸۱

۱-۱-۲-۲۵- انتخاب نمونه ها ………………………….. ۸۲

۲-۱-۲-۲۵- آماده سازي نمونه ها …………………….   ۸۲

۳-۲۵- تستهاي بيوشيمي……………………………. ۸۳

۴-۲۵- روشهاي سرولوژي……………………………. ۸۵

۱-۴-۲۵- عوامل موثر در آزمايشات سرولوژي ………………     ۸۵

۲-۴-۲۵- تست مهاري رشد ……………………………. ۸۷

۳-۴-۲۵- تست ايمونو فلورسانس ……………………….. ۸۸

۴-۴-۲۵- تست رسوب ژلي…………………………….. .. ۸۸

۵-۴-۲۵- تست فيکساسيون کامپلمان …………………….. ۸۹

۶-۴-۲۵- تست ممانعت از هماگلوتيناسيون ……………….. ۸۹

۷-۴-۲۵- تست آگلوتيناسيون لاتکس…………………….. ۹۰

۸-۴-۲۵- تست اليزاي رقابتي………………………… ۹۱

۹-۴-۲۵- ساير تستهاي تشخيصي……………………….. ۹۴

۵-۲۵ – مشکلات روشهاي سنتي………………………… ۹۴

۶-۲۵- تشخيص با استفاده از PCR……………………. 95

فصل دوم: روش کار

۲۶- روش کار …………………………………… ۱۰۱

۱-۲۶- جمع آوري نمونه ……………………………… ۱۰۱

۱-۱-۲۶- مواد لازم………………………………….. ۱۰۱

۲-۱-۲۶- بخش جمع آوري نمونه……………………….. ۱۰۱

۳-۱-۲۶- نمونه برداري ……………………………. ۱۰۳

۲-۲۶- کشت و جداسازي نمونه ها……………………… ۱۰۴

۱-۲-۲۶- مواد لازم ……………………………….. ۱۰۴

 

۲-۲-۲۶- طرز تهيه محيط کشت اختصاصي براي جداسازي مايکوپلاسماي نشخوار کنندگان         ۱۰۶

۱-۲-۲-۲۶- مواد لازم ……………………………… ۱۰۶

۲-۲-۲-۲۶- روش تهيه محيط کشت…………………………. ۱۰۷

۳-۲۶- استخراج DNA مايکوپلاسما…………………….. ۱۰۹

۱-۳-۲۶- روش استخراج DNA از نمونه هاي ارسالي………….. ۱۰۹

۴-۲۶- فرايند PCR ………………………………. 110

۱-۴-۲۶- مواد لازم ……………………………….. ۱۱۰

۲-۴-۲۶- آماده سازي مواد جهت واکنش PCR ………………. 112

۱-۲-۴-۲۶- افزوده سازي DNA نمونه‌ها ……………….. ۱۱۲

۲-۲-۴-۲۶- افزوده سازي DNA کلونيهاي جدا شده………… ۱۱۵

۳-۲-۴-۲۶- تهيه مخلوط اصلي اوليه…………………… ۱۱۵

۳-۴-۲۶- پرايمرها………………………………… ۱۱۵

۴-۲۶- واکنش PCR………………………………… 117

۵-۲۶- تهيه ژل الکتروفورز ……………………….. ۱۱۸

۱-۵-۲۶- طرز تهيه محلول اتيديوم برمايد ………………. ۱۱۹

۶-۲۶- الکتروفورز …………………………………. ۱۲۱

۷-۲۶- رويت باندهاي ايجاد شده ……………………. ۱۲۲

 

فصل سوم: نتايج

۲۷- نتايج …………………………………….. .. ۱۲۴

۱-۲۷- جداسازي………………………………….. ۱۲۴

۱-۱-۲۷- بررسي عملکرد محيط کشت…………………….. ۱۲۴

۲-۱-۲۷- نتايج کشت نمونه هاي ارسالي ……………….. ۱۲۴

۱-۲-۱-۲۷- نتايج روز پنجم ……………………….. ۱۲۵

۲-۲-۱-۲۷- نتايج روزهفتم تا دهم……………………. ۱۲۵

۳-۲-۱-۲۷- نتايج روزپانزدهم……………………….. ۱۲۶

۲-۲۷- نتايج PCR ………………………………… 126

۱-۲-۲۷- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر جنس ………… ۱۲۶

۲-۲-۲۷- تائيد کلوني هاي جدا شده…………………… ۱۲۷

۳-۲-۲۷- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر کلاستر مايکوئيدس. ۱۲۷

۴-۲-۲۷- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر گونه آگالاکتيه… ۱۲۸

۵-۲-۲۷- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر گونه مايکوئيدس کلوني بزرگ          ۱۲۹

۳-۲۷- نتايج کالبد گشايي…………………………. ۱۳۰

۱-۳-۲۷- معيار انتخاب ……………………………. ۱۳۰

 

فصل چهارم: بررسي نتايج

نمودارها…………………………………………. ۱۳۱

فصل پنجم: بحث

۲۸- بحث …………………………………………. ۱۳۹  

۱-۲۸- ضايعات کالبد گشايي…………………………… ۱۳۹

۲-۲۸- ميزان وقوع عفونت تنفسي مايکوپلاسما ………….. ۱۴۱

۳-۲۸- روش کشت………………………………….. ۱۴۲

۴-۲۸- روش PCR ………………………………… 147    

۵-۲۸- فراواني گونه ها ………………………….. ۱۵۲

۲۹- خلاصه انگليسي……………………………….. ۱۵۹

۳۰- منابع …………………………………….. .. ۱۶۰

 

فهرست تصاوير

عنوان  …………………………………………………………

 

تصوير شماره ۱: کلوني تخم مرغي شکل مايکوپلاسما پس از سومين ساب کالچر ۱۲۵

 

تصوير شماره ۲: آزمايش PCR براي تشخيص جنس مايکوپلاسما در نمونه ريه   ۱۲۷

 

تصوير شماره ۳: آزمايش PCR براي تشخيص کلاستر مايکوئيدس در نمونه ريه       ۱۲۸

 

تصوير شماره ۴: آزمايش PCR براي تشخيص گونه آگالاکتيه درنمونه ريه                   ………………………………………                            ………………………………………                            ………………………………………                            ………………………………………               ۱۲۹

تصوير شماره ۵: آزمايش PCR براي تشخيص گونه مايکوئيدس مايکوئيدس کلوني بزرگ ۱۳۰

 

فهرست جداول

عنوان  ……………………………………………………………………….

جدول۱: طبقه بندي مايکوپلاسما……………………….. ۱۱

جدول ۲: معرفي اعضا کلاستر مايکوئيدس و خصوصيات بيماريزايي آنها  ۱۱

جدول ۳: احتياجات غذايي براي رشد مايکوپلاسماهاي کلاستر مايکوئيدس  ۳۹

جدول ۴ : مقادير موردنياز جهت تهيه مخلوط اصلي اوليه…. ۱۱۲

جدول ۵: مواد مورد نياز واکنش تکثير ………………. ۱۱۴

جدول۶ : پرايمرهاي استفاده شده در واکنش تکثير ……… ۱۱۶

جدول ۷ : برنامه واکنش پرايمرها ………………….. ۱۱۸

جدول۸: : فرمول تهيه محيط TBE(5X)…………………. 120

جدول۹: ميزان اتيديوم برومايد مصرفي جهت ساختن مقادير متفاوت ژل ۱۲۰

 

فهرست نمودارها

عنوان ……………………………………………………………………

نمودار شماره ۱: درصد مايکوپلاسماي جدا شده به روش کشت در عفونت تنفسي

گله‌هاي مورد مطالعه…………………………….          ۱۳۲

نمودارشماره ۲: درصد حضور مايکوپلاسما درعفونت تنفسي گله‌هاي مورد

مطالعه به روشPCR …………………………….. 132

نمودار شماره۳ : مقايسه روشهاي کشت و PCR در تشخيص مايکوپلاسما ي موجود در عفونت تنفسي گله‌هاي مورد مطالعه…………………. ۱۳۳

نمودار شماره۴: مقايسه نتايج کشت وPCR نمونه‌ها در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100)     ۱۳۳

نمودار شماره ۵: مقايسه نتايج کشت و PCR مايکوپلاسما در گاو (n=50)    ۱۳۴

نمودار شماره ۶: مقايسه نتايج کشت و PCR مايکوپلاسما در گله هاي گوسفند (n=30) 134

نمودار شماره ۷: مقايسه نتايج کشت و PCR در گله‌هاي بز (n=20)     ۱۳۵

نمودار شماره۸: نمودار شماره ۸:مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100) ………… 135

نمودار شماره ۹: نمودار شماره۹:مقايسه نتايج ايجاد کدورت در محيط براث و جداسازي مايکوپلاسما در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100) …. 136

نمودار شماره ۱۰: نمودار شماره۱۰: مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR   مايکوپلاسما
در گله‌هاي گاو(n=50)……………………………. 136

نمودار شماره ۱۱: نمودار شماره ۱۱:مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما
در گله‌هاي بز (n=20)……………………………. 137

نمودار شماره۱۲: مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي گوسفند (n=30) …………………………. 137